马伊琍15岁时参加上海电视台的综艺舞蹈队,正式自食其力自己赚取学费。
1993年,马伊琍被选中主演电影《刘海粟》,那是她第一次扮演电影角色,收获800元片酬。1994年,归汽考入上海戏剧学院94级表演系本科。1996年,在电视剧《真空爱情记录》中扮演夏文心,讲述了一群大学毕业生为了工作和爱情奋斗的故事。1998年,毕业于上海戏剧学院,毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》,马伊琍扮演“小丫子”,同一年参与演出的第一部古装电影《孔乙己》至今没有公映。
2000年,马伊琍参与演出了《黑洞》扮演三陪女,马伊琍的表演事业得到了更好的提升,在电视剧《前世今生》中扮演美貌且气质超凡的秦婉莹。2001年,参与演出电视剧《白天睡觉的女人》扮演李秀,在电影《西施眼》中扮演施雨,该剧在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。
2002年,马伊琍因参与演出电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中夏紫薇一角而被大众所熟知。2004年,参与演出了由黄磊指导的《天一生水》扮演一个混血姑娘明妮。2005年,参与演出张黎导演的电视剧《锦衣卫》在剧中就参与演出了一个这样的倾国美人客印月。2006年,参演《乔家大院》扮演的“江雪瑛”。2007年,参与演出由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》夏琳一角而知名度得到进一步的提升。
2008年,马伊琍因拍电视剧《为谁心动》时无悔剃光了头,凭借影片《江北好人》,马伊琍战胜了李冰冰、范冰冰两悼叠燥汽位大热候选人,成为了长春电影节影后。2009年,和佟大为共同参与演出了电视剧《婚姻保卫战》演出夫妻间放洒寒事。同一年马伊琍参与演出了首部反映豫商故事的电视剧《经纬天地》在CCTV-8播出,这也是她继《乔家大院》之后第一次登陆央视,马伊琍扮演尚达志的妻子顺儿,这也是马伊琍生产复出首部电视剧作品。
2010年,马伊琍和涂松岩领衔主演的都市题材电视剧《双城生活》反映了“双城恋”话题,让许多霉誉燥观众产生了不小共鸣并引发了网络热议,而马伊琍在剧中扮演北京大妞郝京妮。凭借该剧获得国剧盛典2011年度最佳女演员。2013年,年初马伊琍与杜淳、刘莉莉、陈思斯等众多明星合作电视剧《青春期撞上更年期Ⅱ》,此外,还客串电影《不二神探》,并且彻底颠覆以往的形象。同一年,首当制片人的捆立尝放马伊琍与第一次当导演的丈夫文章合作的电视剧《小爸爸》。
2015年,马伊琍参与演出了公路犯罪片《未择之路》。电视剧《北上广不相信眼泪》于11月7日在北京卫视、浙江卫视播出;7月16日,参演的民国时期战争题材作品《那些女人》正式杀青。2016年1月份,与陈建斌领衔主演的当代都市幽默轻喜剧《中国式关系》于在北京杀青。劝茅蒸4月份,在文章执导的谍战剧《剃刀边缘》中扮演女主角。2017年,主演都市情感剧《我的前半生》,在剧中扮演罗子君,凭借该剧获得第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳女主角。
2018年,马伊琍凭借电影《那些女人》获得第21届上海国际电影节电影频道传媒关注单元最佳女配角奖;9月14日,其主演的犯罪电影《未择之路》上映,片中扮演一名卡车司机小眉;9月30日,和姚晨共同主演的剧情片《找到你》上映。
2019年4月6日,马伊琍和高伟光主演的民国探案剧《爱思小姐探案集》在横店开机,在剧中扮演了法租界警务局中央巡捕房探员苏雯丽;4月26日,凭借电影《找到你》获得第10届中国电影导演协会年度女演员奖;6月12日,凭借电影《找到你》获得第25届华鼎奖中国电影最佳女主角;6月份,将担任第25届上海电视节白玉兰奖电视剧类别中国电视剧单元评委;9月22日,和刘烨合作主演的都市创业剧《在远方》播出;10月22日,凭借电影《找到你》提名第32届中国电影金鸡奖最佳女主角;11月份,主演由薛晓路执导的职场现实题材剧《在不安的世界安静地活》,在剧中扮演林墨。
2020年8月28日,马伊琍和高伟光主演的民国探案剧《旗袍美探》播出。2021年3月20日,担任主演的电影《爱情神话》开机并官宣阵容。
马伊琍人物评价
我这个人婚前很擅长主外,婚后就开始慢慢学会主内,现在我是内外兼修的婚姻选手。我结婚前比较“大女人”一些,但与文章婚后,学会了在外“大女人”,在家“小女人”。(自评)
这个角色让马伊琍充分展示了极宽的戏路。(赵宝刚评)
她是好演员的代表。(朱亚文评)